山西省农业农村厅办公室关于做好非洲猪瘟新型基因缺失*株防控工作的通知各市农业农村局，厅属有关事业单位：为进一步做好非洲猪瘟防控工作，落实《农业农村部畜牧兽医局关于做好非洲猪瘟新型基因缺失*株防控工作的通知》（农牧便函〔〕号）要求，防范非洲猪瘟国外IL基因缺失疫苗（以下简称“基因缺失疫苗”）流入我省，确保全省生猪产业稳定发展，现就有关事项通知如下。一、严防国外疫苗*株流入我省各市要密切配合海关等部门，加大监管查处力度，严防国外基因缺失疫苗、生猪及生猪产品非法进入我省。进一步加强疫苗销售使用监管，强化生猪及生猪产品调运监管，加强对广西、云南等边境省份调入我省的生猪及生猪产品的查验力度，如发现基因缺失疫苗或未附具动物检疫合格证明（动物卫生证书）的生猪及生猪产品，要做好溯源和查处工作；有证据证明是境外输入的，应依法依规移交海关、公安等部门处理。二、加强疫苗*株专项监测流调继续做好非洲猪瘟监测工作，落实《山西省年规模养殖场等场所非洲猪瘟监测实施方案》安排部署，按照时间节点要求做好规模猪场及其周边屠宰场、无害化处理场、生猪运输车辆等重点场所采样监测工作，对于实验室检测过程中发现的阳性样品及时送省动物疫病预防控制中心，按照“非洲猪瘟病*IL基因缺失*株鉴别检测规范”（见附件）进行鉴别检测。三、组织做好宣传解读工作各市要适时组织相关科研院校、养殖企业的专家和技术人员，通过现场培训、自媒体等多种方式，科学、客观介绍基因缺失疫苗试验数据情况，普及基因缺失疫苗对种母猪和仔猪的危害知识，帮助广大养殖场认清基因缺失疫苗对生猪生产的影响。同时，要加强非洲猪瘟科学防控知识宣传，督促指导养殖场户增强自主防范意识，采取生物安全防控措施，积极营造群防群控的良好局面。四、严格执行非洲猪瘟疫苗＂五禁止＂监管措施各市要继续严格执行非洲猪瘟疫苗“五禁止”监管措施，禁止未经批准开展实验活动，禁止未经审批开展临床试验，禁止生产非法疫苗，禁止经营非法疫苗，禁止使用非法疫苗。要进一步加大对非洲猪瘟疫苗相关违法行为查处力度，发现违法制售非洲猪瘟疫苗、违法经营所谓“非洲猪瘟中试苗、自家苗”或走私苗等非法疫苗、违法接种使用非法疫苗的，要依照《兽药管理条例》和《兽药严重违法行为从重处罚情形》有关规定从严从快从重处理。涉嫌犯罪的，及时依法移送公安机关追究刑事责任。对养殖场户使用非法疫苗免疫接种的猪只，一经检测为阳性，视为非洲猪瘟感染猪，予以扑杀，并不得给予补助。附件：非洲猪瘟病*IL基因缺失*株鉴别检测规范山西省农业农村厅办公室年6月23日
附件
非洲猪瘟病*IL基因缺失*株鉴别检测规范本规范适用于非洲猪瘟病*IL基因缺失*株的荧光PCR检测。1主要试剂1.1病*DNA提取试剂盒。1.2无核酸酶的水。1.3探针法荧光PCR预混液。1.4引物和探针:P72和IL基因扩增引物和探针，均由国家非洲猪瘟参考实验室设计、提供。1.5阳性和阴性对照:每次荧光PCR检测，应加阳性对照、阴性对照。阳性对照为ASFV基因组DNA标准物质。阴性对照用水替代样品DNA。2主要仪器设备2.1荧光PCR仪。2.2台式低温高速离心机。2.3组织匀浆仪。2.4全自动核酸提取仪。2.5微量可调移液器。2.6无核酸酶的离心管、PCR管和吸头。3样品采集和运输保存在活体检查时，可采集猪的抗凝全血(EDTA抗凝)、口鼻拭子或者血清等；病死猪可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织病料。尽快送至实验室进行病*核酸检测。样品的采集、运送与保存应满足NY/T《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》的相关要求。样品可在4℃最长保存2天，长时间保存应在-20℃以下冷冻保存。4样品处理4.1组织样品取0.1g-0.2g组织样品切成小碎块，加入lmL-2mL预冷的PBS缓冲液(pH7.4)用组织匀浆仪高速匀浆，制成10%组织匀浆液，r/min离心10min，取μL清液进行核酸提取。4.2液体样品抗凝全血、血清等液体样品,直接取μL提取核酸。5病*核酸提取采用病*DNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪提取病*核酸。提取后的核酸溶液应立即使用或置于-20℃以下冷冻保存(6个月内使用)。6荧光PCR检测6.1荧光PCR反应液制备在无核酸酶的离心管中制备荧光PCR反应混合液，组成包括：P72基因和IL基因探针预混液、2×探针法荧光PCR预混液和无核酸酶的水。反应体系配制见下表。表1每个反应体系配置
6.2荧光PCR扩增条件50℃2分钟；95℃5分钟；95℃15秒，60℃1分钟，40个循环，在每一循环的60℃时收集FAM和VIC荧光信号。6.3结果分析Ct值由荧光PCR仪软件自动确定。6.3.1试验成立条件阳性对照中P72和IL基因的Ct值均应35且出现特异性扩增曲线，阴性对照的P72和IL基因均应无Ct值或Ct值≥40且无特异性扩增曲线。同时满足上述条件时试验结果有效，否则应重新进行试验。6.3.2检测结果判定FAM通道对应P72基因，VIC通道对应IL基因。被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线时，判为目标基因阳性；无Ct值或Ct值≥40时，判为目标基因阴性；38Ct值40且出现特异性扩增曲线时，判为疑似。对疑似样品,再进行1次复检，做3个重复；有2个重复Ct值40且出现特异性扩增曲线时，判为目标基因阳性，否则判为目标基因阴性。6.3.3综合判定最终判定应结合P72和IL两个基因的检测结果进行综合分析,具体判定标准见表2。表2综合判定标准
注:“+”代表阳性；“-”代表阴性。
来源：山西省农业农村厅办公室
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