中华人民共和国农业农村部公告第号根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定，经审查，批准广东省农业科学院动物卫生研究所等11家单位申报的非洲猪瘟病*核酸恒温荧光扩增检测试剂盒等2种兽药产品注册，并发布产品工艺规程、质量标准、说明书和标签。自发布之日起执行。特此公告。附件：1.注册目录2.工艺规程3.质量标准4.说明书和标签农业农村部年11月11日
附件1：
附件2：（略）
附件3：（略）
附件4：
说明书和标签
一、非洲猪瘟病*核酸恒温荧光扩增检测试剂盒说明书和内包装标签
（一）非洲猪瘟病*核酸恒温荧光扩增检测试剂盒说明书
兽用
通用名非洲猪瘟病*核酸恒温荧光扩增检测试剂盒
商品名无
英文名AfricanSwineFeverVirusNucleicAcidFluorescentIsothermalAmplificationDetectionKit
汉语拼音FeizhouzhuwenBingduHesuanHengwenYingguangKuozengJianceShijihe
用于猪血液、脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肌肉等样品中非洲猪瘟病*核酸的检测。
1用法
1.1待检样品采集、保存及运输
1.1.1样品采集
1.1.1.1血液样品无菌采集抗凝血或血清5ml。
1.1.1.2组织样品无菌采集脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肌肉等组织样品，2℃～8℃低温运输至实验室用于检测。
1.1.2样品保存采集的样品在2～8℃保存应不超过24小时，-70℃条件下可长期保存，避免反复冻融。
1.1.3样品运输保温箱加冰袋后密封进行运输。包装和运输应符合农业农村部《高致病性动物病原微生物菌（*）种或者样本运输包装规范》和交通运输部门关于危险品运输管理的有关规定。
1.2样品处理
1.2.1血液样品处理待检样品需先在60℃条件下灭活30分钟。抗凝血样品在灭活后置于离心管中，g离心10分钟，取μl上层血浆于RNase/DNase–free无菌离心管中，编号备用。非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，g离心10分钟，取μl上层血清于RNase/DNase–free无菌离心管中，编号备用。
1.2.2组织样品处理取适量脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肾脏、肌肉等组织，置于研磨器或研磨管中研磨，在60℃条件下灭活30分钟，再加适量生理盐水或PBS混匀，制成约10%（g/ml）的组织匀浆，0g离心5分钟，取μl上清于RNase/DNase–free无菌离心管中，编号备用。
1.3病*核酸的提取用商品化的磁珠法或柱膜法核酸提取试剂盒按其说明书操作方法提取DNA核酸。
1.4核酸扩增
1.4.1取出试验需要数量的干粉反应管，设定为n。其中n=阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+待检样品数。
1.4.2在取出的干粉反应管中依次加入BufferA42.5l，然后加入5l待检样品，最后管内盖依次加入BufferB2.5l。每次检测应设立阳性对照和阴性对照，按照上述加样方式进行操作，阳性对照、阴性对照的加样量为5l。
1.4.3将以上干粉反应管盖好管盖，瞬时离心，充分混匀，用力上下颠倒振荡10次，再次瞬时离心，确保管壁上不沾有液滴。
1.4.4将配置好的体系立即放入MA–型等温荧光PCR仪，设置反应程序为：39℃，采光间隔30秒，反应时间20分钟，收集荧光信号，荧光通道选择FAM通道。
2结果判定
2.1结果分析条件的设定设置阈值为，基线期：起始值设置为1.0min，终止值设置为3.0min。每个样品反应管内的荧光信号累积达到设定的阈值时所经历的时间（ThresholdTime）即为TT值。
2.2试验成立条件阳性对照有典型的扩增曲线出现，且TT值≤15.0min；阴性对照无TT值且无典型的扩增曲线，则试验结果成立；否则结果不成立。
2.3样品结果判定
2.3.1若TT值≤17.5min，且有典型的扩增曲线，判定为阳性；
2.3.2若无TT值且无典型的扩增曲线，判定为阴性；
2.3.3若17.5min＜TT值≤20.0min，且出现典型的扩增曲线，判为可疑，建议重复检测进行确认。重复检测后，若TT值≤20.0min，且有典型的扩增曲线，则判定为阳性。
（1）本试剂盒仅用于体外诊断使用，操作人员必须经过培训。试验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按照操作步骤执行，在操作过程中对时间、试剂体积等精确控制可以获得最好的结果。
（2）实验室应严格按照有关规定分区管理，依照配液区→模板提取区→扩增区→分析区顺序进行基因检测。各区间人员、器材、试剂及空气流向应有严格要求。
（3）核酸提取有关耗材确保洁净、无DNase/RNase，提取过程尽量低温、快速，完成后进入下一步试验或冻存。
（4）对于顶部采光仪器要带新的一次性PE手套对样品管封盖，对于底部采光仪器要避免徒手或使用过的手套接触样品管管底，检测过程中使用不带荧光物质的一次性乳胶手套。
（5）冻存试剂使用前应于室温下完全融化，瞬时离心使液体完全沉于管底。避免反复冻融，以免影响试剂性能。操作时应注意避光，避免强光暴露和长时间光照。
（6）待检样品、阳性对照等在使用后及时封盖，避免组分间及气溶胶等的污染造成假阳性。
（7）在向干粉反应管中加入BufferA、BufferB和待测样品后，务必充分混匀，并立即上机检测。
（8）扩增产物禁止开盖，试验产生的废弃物应及时收集，远离PCR实验室进行无害化处理。
32个检测/盒
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
（二）非洲猪瘟病*核酸恒温荧光扩增检测试剂盒内包装标签
兽用
非洲猪瘟病*核酸恒温荧光扩增检测试剂盒
32个检测/盒批准文号：
批号：
有效期至：
详见说明书。
详见说明书。
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
干粉反应管
16管/袋
批号：
有效期至：
详见说明书。
详见说明书。
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
BufferA
μl/管
批号：
有效期至：
详见说明书。
详见说明书。
-20℃以下避光保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
BufferB
90μl/管
批号：
有效期至：
详见说明书。
详见说明书。
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
阳性对照
μl/管
批号：
有效期至：
详见说明书。
详见说明书。
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
阴性对照
μl/管
批号：
有效期至：
详见说明书。
详见说明书。
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
二、非洲猪瘟病*荧光PCR检测试剂盒说明书和内包装标签
（一）非洲猪瘟病*荧光PCR检测试剂盒说明书
兽用
通用名非洲猪瘟病*荧光PCR检测试剂盒
商品名无
英文名AfricanSwineFeverVirusFluorescencePCRDetectionKit
汉语拼音FeizhouZhuwenBingduYingguangPCRJianceShijihe
用于猪口鼻眼拭子、猪肉组织、猪脏器、血液、血清等样本中非洲猪瘟病*核酸的检测。
1用法
1.1样本的采集、处理和保存采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴一次性手套。采集的样本一律进行灭活处理。
1.1.1采样器具拭子、剪刀、镊子、一次性注射器、采样管（1.5ml离心管或其他规格）、采样袋。所有采样器具应无菌处理（高温干烤或高压灭菌）。
1.1.2样本采集
1.1.2.1口鼻眼拭子样本用专用采样拭子，适度拭抹口腔分泌物和鼻腔分泌物，眼分泌物要用拭子在眼睑下充分擦拭，迅速将拭子放入装有μl样本稀释液的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。将采集的样本置于65℃水浴灭活30分钟。
1.1.2.2猪肉组织及脏器用无菌剪、镊采集待检脏器，装入无菌采样袋或其它灭菌容器。将采集的样本置于65℃水浴灭活30分钟。
1.1.2.3血液和血清抽取猪静脉血1ml，置于含有适量抗凝剂的采血管中（抗凝剂建议采用EDTA或柠檬酸三钠，不应采用肝素）。将采集的样本置于65℃水浴灭活30分钟。抽取猪静脉血1ml,注入无菌收集管中，放室温不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接rpm离心5分钟获取血清，转移至新的灭菌离心管中。将采集的样本置于65℃水浴灭活30分钟。
1.1.3样本保存采集的灭活待测样本可立即用于检测，灭活待测样本在2～8℃保存不应超过三天；-20℃以下保存不超过一个月；-70℃以下可以长期保存。应避免反复冻融。
1.1.4样本处理
1.1.4.1猪口鼻眼拭子无需样本处理，混匀后即可取5μl拭子悬液直接上样。
1.1.4.2猪肉组织和脏器样本无菌取黄豆粒大小的样本（约0.1g）置于无菌1.5ml离心管中后，加入μl样本稀释液，使用组织研磨器充分研磨至匀浆。另取出一个新的无菌1.5ml离心管，加入15μl的组织样本裂解液，再加入15μl的上述组织匀浆液，涡旋混匀，置于95℃加热5分钟后，10rpm离心2分钟，吸取上清液5μl上样。
1.1.4.3全血样本用样本稀释液进行10倍稀释后，即可取5μl直接上样。
1.1.4.4血清样本用样本稀释液进行5倍稀释后，即可取5μl直接上样。
1.2荧光PCR扩增
1.2.1扩增试剂准备取出PCR反应液、阴性对照和阳性对照，待所有组分完全溶解后，振荡混匀5秒，瞬时离心5秒。
1.2.2配制反应体系按下表体系，在PCR管中配制反应体系。
以上操作建议在冰浴条件下进行，加样完毕后压紧管盖，瞬时离心。
1.2.3PCR扩增
1.2.3.1将反应管放置于PCR仪内，记录加样顺序，同时按下表设置反应条件。
1.2.3.2荧光通道的选择选择FAM通道检测ASFV的核酸。
2判定
2.1质控标准
2.1.1阴性对照FAM检测通道无S型扩增曲线且无Ct值。
2.1.2阳性对照FAM检测通道有典型S型扩增曲线且Ct值≤23.0。
2.1.3试验成立阴性对照和阳性对照检测均符合上述结果，则试验有效，否则此次试验无效。
2.2结果判定
2.2.1阴性如果样本在FAM通道无典型S型扩增曲线且无Ct值或Ct值≥27.0，则判定为非洲猪瘟病*核酸检测阴性。
2.2.2阳性如果样本在FAM通道有典型Ct值≤23.0，并有典型S型扩增曲线，则判定为非洲猪瘟病*核酸检测阳性。
2.2.3复检如果样本Ct值在23.0～27.0之间，判为可疑进行重检，如重检结果Ct值＜27，且有明显扩增曲线，则判定为非洲猪瘟病*核酸检测阳性；若Ct值＜27.0，但无明显扩增曲线或Ct值≥27.0或无Ct值，判定为非洲猪瘟病*核酸检测阴性。
（1）开始检测前请仔细阅读本说明书，按要求操作。
（2）各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染；试验后立即清洁工作台。
（3）扩增产物的污染，很容易出现假阳性结果。因此，临床试验室应严格按照《临床基因扩增试验室工作规范》配备设备及操作人员。
（4）本试剂盒仅在兽医指导下使用，对病猪的临床诊治应结合其症状/体征，病史，其他试验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
（5）检测为阴性，并不完全代表为非感染状态，具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。造成检测为阴性的可能是：①不合理样本采集、转运及处理、样本中病*浓度过低，②未经验证的其他干扰因素如：服用抗病*药物等。
（6）样本中DNA浓度低于本产品的最低检出限时可能出现假阴性。
（7）核酸反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各荧光定量PCR反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。
（8）扩增完毕立即取出荧光定量PCR反应管，密封在自封袋内并做无害化处理。
（9）待检样本需要按照有潜在传染性的材料处理，对样本及其废弃物的操作和处理必须严格遵守生物安全规定。
（10）试验中用过的离心管、Tip头等耗材请打入盛有消*液的废物缸内，并与其他废弃物品一同做无害化处理。
（11）检测场所、工作台及各种试验用品定期用1%次氯酸钠、75%酒精或紫外灯进行消*。
（1）24个检测/盒（2）50个检测/盒（3）个检测/盒
本试剂盒中组织样本裂解液和样本稀释液应储存于2～8℃；其余组分应储存于-20℃以下避光条件，有效期均为12个月。
仅供兽医诊断使用
（二）非洲猪瘟病*荧光PCR检测试剂盒内包装标签
兽用
非洲猪瘟病*荧光PCR检测试剂盒
24个检测（50个检测、个检测）/盒批准文号：
批号：
有效期至：
详见说明书。
详见说明书。
-20℃以下避光保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
非洲猪瘟病*荧光PCR检测试剂盒
24个检测（50个检测、个检测）/盒批准文号：
批号：
有效期至：
详见说明书。
详见说明书。
2～8℃保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
PCR反应液
μl/管（μl/管）
批号：
有效期至：
详见说明书。
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
阴性对照
50μl/管（μl/管、μl/管）
批号：
有效期至：
详见说明书。
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
阳性对照
50μl/管（μl/管、μl/管）
批号：
有效期至：
详见说明书。
-20℃以下保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
组织样本裂解液
μl/管
批号：
有效期至：
详见说明书。
2～8℃保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
兽用
样本稀释液
12ml/管
批号：
有效期至：
详见说明书。
2～8℃保存，有效期为12个月。
仅供兽医诊断使用
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