1.全病*疫苗纯化
目前，国内动物疫苗上游培养工艺发展迅猛，而下游分离纯化工艺技术相对滞后，并且随着国外高质量动物疫苗对中国市场的冲击，国家新质量控制要求法规的出台，对于以提高有效抗原产量、降低产品杂质（培养基成分、细胞成分）含量为目标的下游纯化工艺的需求越发迫切。
兽用病*疫苗纯化与人用疫苗质量标准不同，但主要杂质成分相近，从细胞破碎获取病*开始，杂质包含细胞碎片、脂类物质、宿主蛋白、核酸、酚红、牛血清白蛋白BSA、色素、培养基中未知的化学成分等。通过合理有效的下游纯化工艺，在去除杂质，满足产品质量要求的基础上，保证工艺稳定，降低工艺成本，对于兽用疫苗企业更为重要。
图1动物病*疫苗纯化
我们以猪圆环病*和狂犬病*纯化为例，探讨一下病*疫苗下游工艺的开发。
图2猪圆环病*纯化工艺
图3狂犬病*纯化工艺
1充分了解病*性质
通过查找大量文献、专利或与专家沟通，确定病*基本性质，包括病*粒子大小、病*形状、有无囊膜、温度耐受性、pH耐受范围、盐浓度耐受范围、有无特殊稳定剂等，如果对资料不放心，可以自己做一下稳定性实验，整理后开始下游工艺的开发。
2明确纯化目的
确定最后产品的质量要求，包括：蛋白去除率、色素去除率、内*素含量、核酸含量、病*收率等，根据实际需要设计下游工艺路线。在一个完整下游工艺中，不同的处理阶段对杂质的去除具有选择性，并且每一步去除杂质的好坏，对下一步工艺的进行至关重要。例如：如果最开始病*液澄清效果不好，则会导致下一步超滤浓缩或层析效果大打折扣，即会堵塞膜包或填料，影响材料使用寿命，而且会导致病*活性损失增大，影响工艺的正常进行。
图4工艺及其设计目的
3膜过滤
在病*疫苗下游纯化中，膜过滤主要应用为微滤澄清病*液，以及超滤浓缩病*液并置换溶液。这一看似简单的工艺方法往往容易被忽视，从而影响下游进一步纯化。在微滤过程中，往往选择多层微滤组合的方式（例如：0.8um–0.45um等），其效果要优于使用单一滤膜。病*的超滤浓缩在病*纯化过程中极其重要，不仅能够浓缩病*，减少后续工艺时间，而且能够除去大量杂质。需通过选择合适的膜孔径，控制剪切力、流速、样品通量、缓冲液成分、洗滤倍数等条件，获得高病*回收率。
4层析纯化
传统经典的病*纯化工艺是凝胶过滤层析与离子交换层析相结合，在病*液经洗滤浓缩后，凝胶过滤能有效去除99%以上的杂蛋白等小分子物质，后接离子交换层析能除去残留的负电荷杂质，当然也有病*通过其他方式纯化，只是这种组合较为通用。兽用病*疫苗质量要求低于人用疫苗，所以，根据最终产品质量要求，兽用疫苗纯化所选择的方式也会有所不同。对于这最常用的两种纯化方式，凝胶过滤层析纯化病*，其优势在于纯度高，收率高，但上样量低；离子交换层析纯化病*，其优势在于上样量大，但载量低，收率低；对于不同的病*，在实际应用各种层析方法时，其实验结果会有区别，以上述猪圆环病*纯化为例，由于病*颗粒较小17–20nm，对于高纯度、高收率的凝胶过滤层析，其病*峰与杂质峰并不能完全分开，导致收率降低，反而通过离子交换层析（PuroseVirusQAE）能够兼顾病*纯度和收率，并且具有高上样量的优势；对于狂犬病*而言，病*颗粒较大，病*呈子弹状，直径65–80nm，长约–nm，通过凝胶过滤层析（Purose4FastFlow（HighRigidity）(超高强度4FF)）能够实现高收率、高纯度，而应用离子交换层析病*收率极低。所以，在选择病*纯化方法时，要以病*自身特性为出发点，尊重实验事实，不要主观盲目以层析方法的优劣势为选择依据。
5仙人指路
如果对病*性质了解不多，对层析方法、填料的选择、下游工艺开发经验不够丰富，千纯生物帮您解决下游工艺开发的各种疑难杂症。多年来，千纯生物一直专注于下游纯化工艺开发，对于兽药疫苗市场经验丰富，并小有成就，完成猪圆环病*、猪腹泻病*、猪蓝耳病*、猪伪狂犬病*、猪流感病*、狂犬病*、犬细小病*的中式级别纯化及部分工业生产，并有大量牲畜疫苗及宠物疫苗下游纯化工艺在研，如有任何专业问题，您可通过下方联系方式与我们联系，千纯生物为中国动物健康保驾护航！
2.亚单位疫苗纯化
近年来，我国兽药企业对新型动物疫苗的研发技术正逐步追赶国际先进动物疫苗企业的脚步，从经典的第一代传统灭活/弱*疫苗的稳定生产，第二代亚单位基因工程疫苗产品的问世，直至第三代DNA核酸疫苗产品的获批，可谓势头正盛！
亚单位疫苗具有安全性好、副作用小、成本低等优点，但相对于纯化病*疫苗，纯化亚单位蛋白疫苗技术难度更高，所涉及到的层析技术更多，下面我们通过千纯生物部分成功的纯化案例，来探讨一下兽用亚单位疫苗的纯化。
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亲和层析纯化重组猪瘟E2蛋白和猪干扰素α
亲和层析包含种类很多，但在兽用亚单位疫苗纯化中，最常用的为固相金属离子亲和层析。重组蛋白在构建时经常加入蛋白标签，以实现促进蛋白可溶性、增加蛋白表达量、方便下游纯化等目的。最为常用的蛋白标签为His标签，His标签蛋白对Ni2具有高选择性的亲和力，所以将Ni2固定在层析介质上，即可分离纯化His标签蛋白，通常一步层析即可实现高纯度，我们此次重点介绍一下His标签蛋白的层析方法。
图1.重组猪瘟E2蛋白（His标签）纯化工艺
图2.重组猪干扰素α蛋白（His标签）纯化工艺
His标签蛋白纯化方法
1）样品预处理：
调节样品pH，中性或弱碱性条件有助于His标签蛋白与介质结合，结合pH在7.2-7.5为佳。如果低或高pH样品在调节pH过程中出现沉淀现象，则尽量接近此范围pH；
加入一定量盐离子能够屏蔽介质因离子交换作用而产生的非特异性吸附，推荐向样品中加入0.5M氯化钠以提高蛋白纯度；
加入一定量咪唑可以屏蔽杂蛋白表面组氨酸等氨基酸集团与介质产生的吸附作用，从而提高蛋白纯度。咪唑用量要根据实际情况进行调整，推荐浓度范围0–40mm/L，此处需注意加入咪唑可能会导致样品pH升高；
保持样品pH和电导值与平衡液相同，以确保工艺的稳定性；
2）平衡条件：
平衡液的配制应按上述样品条件进行调整。
推荐平衡缓冲液：
20mM磷酸盐缓冲液，0.5M氯化钠，0–40mM咪唑，pH7.4
3）洗脱条件：
咪唑作为竞争剂可洗脱下与介质结合的His标签蛋白，通过不同咪唑浓度的阶跃洗脱，可优化目的蛋白最佳洗脱条件，实现杂蛋白与目的蛋白的分离，提高纯度。
推荐洗脱缓冲液：
20mM磷酸盐缓冲液，0.5M氯化钠，40、70、、、mM咪唑（阶跃），pH7.4
注：样品及所以缓冲液均经0.22/0.45μm过滤。
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离子交换层析纯化猪圆环Cap蛋白、重组猪细小病*VP2蛋白和重组猪干扰素α
离子交换层析是最受大家喜爱的一种层析方式，具有载量高、分辨率高、优化空间大、工艺时间短等优势。
图3.猪圆环Cap蛋白纯化工艺
图4.猪细小病*VP2蛋白纯化工艺
图5.重组猪干扰素α纯化工艺
离子交换层析工艺设计及优化方法：
1）筛选离子交换介质及pH条件
一般认为当蛋白所处环境pH值大于其等电点时，蛋白会带有负电，与阴离子交换介质结合；当蛋白所处环境pH值小于其等电点时，蛋白会带有正电，与阳离子交换介质结合。可以通过调节蛋白所处环境pH，从而改变蛋白的带电性，实现蛋白与相应介质的结合，或蛋白流穿。也可在同一带电性下，调节环境pH高低，从而改变蛋白与介质结合能力的强弱。
蛋白与介质结合能力的强弱，不仅与环境pH有关，也与所选层析介质相关，千纯生物提供用于介质筛选的离子交换介质组合装IEXProcessSelectionKit。
平衡缓冲液：配制一系列pH梯度的平衡缓冲液，使各缓冲液之间具有0.5–1个pH单位跨度，对于SP和CM配基，平衡液pH应在4–8之间；对于Q和DEAE配基，平衡液pH应在5–9之间。根据目的蛋白理论等电点和pH稳定性范围，可缩小pH摸索范围。
洗脱缓冲液：用相应平衡缓冲液，添加1M氯化钠，保持pH一致。
样品预处理：控制样品pH及电导值与平衡液相同，推荐使用PudexG-25置换溶液。
平衡：用5–10个柱体积平衡缓冲液，以1mL/min流速平衡预装柱，直至紫外、电导和pH基线平稳。
上样：层析柱平衡好后，以1mL/min流速上样，上样结束后，继续用平衡缓冲液清洗层析柱，直至紫外基线平稳。
洗脱：以1mL/min流速洗脱结合蛋白，一般3–5个柱体积即可。
应用各平衡缓冲液及填料（合理的选择）重复以上实验，根据实验结果选择最适填料及结合pH。
2）筛选平衡缓冲液离子强度
按照上述选定的层析介质及平衡液pH，配置一系列平衡缓冲液，pH相同，但盐浓度具有0.05–0.1M氯化钠的盐离子浓度差异，范围在0–0.5M氯化钠之间变动，操作同上。最终确定使目的蛋白结合的最高离子强度及完全洗脱目的蛋白的最低离子强度。
3）筛选洗脱条件
根据最佳介质和最佳平衡缓冲液条件上样，洗脱时应用盐浓度梯度洗脱方式，梯度为10个柱体积，盐浓度梯度范围在目的蛋白最高结合离子强度及完全洗脱离子强度之间变动。或使用梯度0–50%的1M氯化钠进行洗脱。根据实验结果选择纯度最高的洗脱条件。
4）优化上样量
在保证蛋白纯度的前提下，摸索最佳上样量，通常上样20%-30%载量的样品可获得最佳分辨率，可根据实际实验结果增加上样量。
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多种层析方法去除内*素
细菌内*素（Endotoxin）又称脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），大量存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜，每个大肠杆菌细胞壁大约含万个LPS分子，大肠杆菌表达的重组亚单位蛋白疫苗中含有大量内*素，如果高浓度内*素疫苗注入动物体内，轻则导致动物体温升高、进食量下降，重则导致组织器官供血不足，出现休克，甚至猝死。所以，控制内*素含量对于重组蛋白尤为重要。
图6.层析方法去除内*素工艺概述
去除内*素需要从源头开始控制，在下游纯化工艺中，每一步都要考虑到内*素的去除（例如最开始的菌体收集阶段，对菌体进行清洗就会去除1到2个数量级的内*素），并控制实验环境和设备，以防外来内*素污染。去除内*素没有统一通用的方法，需根据蛋白的性质，设计合理的纯化流程，实现对内*素的控制。
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仙人指路——千纯生物助力下游纯化工艺开发
如果对目的蛋白性质了解不多，对层析方法、填料的选择、下游工艺开发经验不够丰富，千纯生物帮您解决下游工艺开发的各种疑难杂症。多年来，千纯生物一直专注于下游纯化工艺开发，对于兽药疫苗市场经验丰富，并小有成就，完成猪瘟E2蛋白、猪细小病*VP2蛋白和重组干扰素猪α的中式级别纯化及部分工业生产，并有大量宠物、禽类和其他动物亚单位蛋白疫苗下游纯化工艺在研，如有任何专业问题，您可通过下方联系方式与我们联系，千纯生物为中国动物健康保驾护航！
3.更多疫苗纯化案列
猪腹泻病*
猪蓝耳病*
猪流感病*
狂犬病*
猪瘟病*
猪胃肠炎病*
猪伪狂犬病*
貂细小病*
猪瘟E2(昆虫杆状病*表达）
猪瘟E2(CHO表达）
猪圆环PCV2cap（昆虫杆状病*表达）
猪圆环PCV2cap（大肠杆菌表达表达）
猪细小（昆虫杆状病*表达）
貂细小亚单位疫苗
等项目持续研发更新中，请联系千纯生物刘杨（同
